Cellprofilerを用いた共局在解析

GFPとRFPの共局在を数値化する必要があったので、CellProfilerを用いて解析することに。

MeasureColocalizationを用いて解析しようとしたが処理が激重。1枚に1分かかる。

計算する数値を絞ることに。

今回測定したいものは、細胞質に偏在しているタンパク質の一部が凝集体を形成しており、その凝集体と他のタンパク質の共局在である。

厄介なことに、細胞質全体にも蛍光があるため輝度値も含めたパラメータが欲しい。

検討の結果　Rank Weighted Colocalization coefficient（RWC）　を用いることにした。

詳しくはリンクを読めば良いが、簡単な説明としては、画像の輝度値をそれぞれランク付けし、共局在を観察したいチャンネル同士のランクの差を取っている。このため、輝度の情報が含まれた解析となる。

どうやらManderの計算が律速だったらしく1秒くらいで計算できるようになった。

YeastRGBについて

YeastRGBについての覚書　

イスラエルのEmmanuel等が作成した酵母ORFの蛍光写真データーベース

セルグリッド形式で細胞の蛍光写真像（60x）が並べてある。

蛍光タンパク質は従来のN末に付いているコレクションに加えSWAT法（後述）でN及びC末端に付加されているコレクションが使用されている。

C末端にGFP（mNeonGreen）が付いているものは、核膜のマーカーであるNUP49にmScaが付加されているものとメイティングした二倍体。

N末端にGFP（superfolder）が付いているものは、パラドキサス由来のNOP1プロモーター制御下でORFの発現が誘導されている。別の領域でmCherryおよびBFPがそれぞれバックグラウンドで発現している。

複数遺伝子をまとめて検索しダウンロードすることが可能

SWAT法

光らないプラスミドを入れたつもりの酵母光ってしまった。明日入れ直そう。

実験法

酵母ゲノムへの形質転換はプラスミドのそれと比較して相当に効率が悪い。

酵母ゲノムを大規模に改変して合成酵母を作り出すSC2.0というプロジェクトでは、高効率な形質転換法が必要であろうと思われるので、それを参考にしてみたいと思う。

プロジェクトの一環であるこの論文のマテメソからすると、酢酸リチウム法に違いはないのだが、Yeast Genetics に記載してある方法と若干異なる点がある。以下概要

雑記

直前であくせくするのも嫌なので卒論に着手することにした。

卒論のテーマはコロナ明けから始めた実験なのでそれほど大変なこともなかろう楽観視していたが、これがなかなか大変だ。

要は自分の実験を筋に沿って並べるだけなのだが、生来の気性ゆえにデータがあちこちに散らばってる。これを集めるだけでも一苦労。Kのように結果がでるたびにきちんと図にまで落とし込むべきであると痛感せざるを得ない。

脱稿はいつになることやら。